Новый метод "ДНК-печати" позволит создать ген за один день
Создать новый ген за один день или даже за несколько часов? Ещё недавно это казалось немыслимой задачей, однако новая технология сделала мечту многих учёных реальностью.
Команда из Калифорнийского университета и Национальной лаборатории имени Лоуренса в Беркли представила методику, которая позволяет имитировать процесс синтеза ДНК.
Авторы разработки поясняют, что вопрос о создании ДНК изучается уже более 40 лет. Традиционный подход использует нуклеотиды – строительные блоки ДНК, которых существует всего четыре типа – аденин, гуанин, цитозин и тимин. Их нужно добавлять в определённой последовательности к олигонуклеотиду – короткому базовому фрагменту ДНК. Таким образом можно нарастить полноценную цепочку.
Однако этот метод предполагает использование токсичных органических реагентов. Кроме того, из-за высокой вероятности ошибок созданная таким образом цепь ДНК ограничивается лишь 200 основаниями. В масштабах существующих природных генетических кодов это число можно назвать ничтожным. Чтобы собрать даже небольшой ген, исследователям приходится синтезировать его по частям, а затем "сшивать" их вместе, это требует много времени и немалых затрат.
Молодые учёные из США предложили принципиально новый подход, который за быстроту и принцип действия назвали "ДНК-печатью".
"Если вы инженер-механик, очень здорово иметь трёхмерный принтер, который может распечатать деталь за одну ночь, чтобы вы могли проверить её на следующее утро. Если же вы исследователь или биоинженер, и у вас есть инструмент, который упрощает синтез ДНК, вы можете быстро проверить свои идеи и исследовать новые. Думаю, это приведёт к множеству инноваций", — рассказывает соавтор работы Дэн Арлоу (Dan Arlow).
Совместно с приглашённым из Германии коллегой Себастианом Паллуком (Sebastian Palluk) он работал над методами применения ДНК-синтезирующего фермента, который содержится в клетках иммунной системы и позволяет добавлять нуклеотиды к существующей молекуле ДНК. Важное условие: процесс должен происходить в воде, потому что именно в такой среде ДНК наиболее стабильна.
По словам биоинженеров, новый метод повышает точность работы, и в итоге можно создавать нити ДНК длиной до нескольких тысяч оснований. Это размер полноценного среднестатистического гена.
"Мы разработали новый способ синтеза ДНК с применением механизма, который сама природа использует для создания ДНК. Этот подход является многообещающим, потому что ферменты эволюционировали в течение миллионов лет, чтобы достичь высокой "химической точности", — отмечает Паллук.
Он поясняет, что большинство клеток в живых организмах, как правило, не синтезируют ДНК с нуля. Они копируют её с помощью множества различных ферментов, называемых полимеразами, на основе шаблонов, заложенных в клетке при её рождении.
Ещё в 60-х годах учёные обнаружили необычную полимеразу, которая не полагается на существующую ДНК-матрицу, а беспорядочно добавляет нуклеотиды к генам. Таким способом создаются антитела иммунной системы с миллионами генетических вариаций. Благодаря этому механизму они учатся атаковать самые разные патогены.
Фермент, о котором идёт речь, известен как терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT). Он способен добавлять к цепочке ДНК все четыре вида нуклеотидов, наращивает до 200 оснований за минуту, а его использование сводит к минимуму число побочных реакций.
Но есть важный нюанс: TdT добавляет новые буквы к генетическому коду в случайном порядке. Исследователи давно искали способы контроля, чтобы создавать нужные последовательности, и теперь решение найдено.
Арлоу и Паллук начали с того, что добавляли к нуклеотидам химические группы, которые действуют как "стоп-сигналы". В результате фермент мог прикрепить к базовому фрагменту ДНК лишь один нужный нуклеотид. После этого нить ДНК обрабатывали специальным соединением, смывающим "стоп-группу", и подготавливали к прикреплению нового основания.
Но и в этом случае исследователи столкнулись со сложностями: оказалось, что TdT очень придирчив. Прикрепление модифицированных "стоп-группами" оснований занимало очень много времени, поэтому команда немного изменила подход.
Они добавили блокирующую химическую группу не к нуклеотиду, а к самому ферменту TdT. Затем его связывали с нуклеотидами, а их добавляли к базовому фрагменту ДНК олигонуклеотиду. В итоге фермент, прикрепляя основание к молекуле ДНК, оставался привязанным и сам блокировал образование любых дополнительных копий.
После того как молекула ДНК получает новое основание, остаётся лишь "разрезать связующий трос", чтобы высвободить фермент, и разблокировать конец нити для добавления нового нуклеотида, также содержащего свой фермент, пишут авторы.
Такой подход оказался менее затратным (ферментом TdT с учёными поделились культуры бактерий и дрожжей), а также быстрым. Присоединение нового нуклеотида к базовой молекуле занимает от 10 до 20 секунд, а на то, чтобы разблокировать конец цепочки для добавления нового основания, уходит ещё минута.
Правда, авторам ещё предстоит повысить точность технологии. Пока что она составляет 98%, в то время как классические методы синтеза ДНК точны на 99%. По мнению экспертов, чтобы создать "правильную" молекулу ДНК с тысячей оснований, потребуется 99,9% точности.
Если специалистам удастся достичь таких показателей, новый метод произведёт настоящую революцию в синтетической биологии, а также подарит возможность упаковывать гигантские массивы данных в компактные ДНК-архивы (об этой технологии "Вести.Наука" (nauka.vesti.ru) подробно рассказывали ранее).
Кроме того, перестройка генов микроорганизмов позволит создавать новые медицинские препараты, а также топливо.
Более подробно об этой работе рассказывается в статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology.
Добавим, что ранее исследователи открыли новую форму ДНК в живых клетках, которая сильно отличается от привычной спирали, а также внедрили две искусственные буквы ДНК в геном живого организма. Последствия этого эксперимента оказались неожиданными.
