Окончив театральную школу в Одессе, работал актером и режиссером в театрах Архангельска, Ростова-на-Дону, Баку, в Московском театре Революции. В 1934 году после окончания режиссерского факультета ГИТИСа, а затем Киноакадемии при ГИКе, где его мастером был Сергей Эйзенштейна, самостоятельно поставил фильм "Медведь". Этот дипломный фильм принес ему всесоюзную славу и считается самым успешным дебютом в истории отечественного кинематографа. Впоследствии Анненский неоднократно обращался к экранизациям произведений А. П. Чехова  - "Человек в футляре", "Свадьба", "Анна на шее", много работал в области экранизации русской литературной классики — "Княжна Мери" (по М. Ю. Лермонтову) и другие, снимал ленты на современную тему - "Екатерина Воронина". Исидор Анненский является автором сценариев почти всех поставленных им картин.  За заслуги в области киноискусства ему было присвоено звание Заслуженного деятеля искусств России.